i TEMsamprep - technique d'aide a la preparation d'echantillon
Microscopie Electronique en Transmission (MET) : guide de préparation des échantillons

         Préparations préalables
         Autres préparations
         Principe
         But
         Méthode
         Action
         Matériaux
         Mode opératoire
         Appareillages
         Procédures
         Variantes
         Avantages
         Inconvénients
         Artéfacts
         Types d’analyses
         Risques
         Conclusion
         Bibliographie
         Informations complémentaires
- - - Chapitre 7.3 - - -
CONTRASTE 'COLORATION POSITIVE'


   Livre


   Préparations préalables associables

     Enrobage
     Film support continu
     Fixation chimique
     Fixation physique : cryo-fixation
     Substitution-imprégnation-enrobage en mode cryogénique
     Substitution-infiltration-enrobage à température ambiante


   Autres techniques de préparations associables

     Cryo-ultramicrotomie
     Dispersion de matériaux divisés
     Films de suspension congelée
     Immunomarquage
     Ultramicrotomie


   Principe

        But

Cette technique permet de renforcer le contraste des préparations (coupes ultraminces ou particules dispersées) d’échantillon transparents aux électrons. Cette technique est une post-préparation qui vient en complément des préparations de lames minces et s’effectue sur un échantillon déjà déposé sur une grille support.

        Méthode

C’est une addition chimique de métaux lourds sur ou dans l’échantillon comportant des sites réactifs tels que double liaison, pont éthylénique, méthylénique, terminaison alcool ou aldéhyde etc…

        Action

Elle se fait par réaction chimique d’oxyde ou des sels de métaux lourds.

        Matériaux

Elle peut être réalisée sur tous types d’échantillons ne comportant que des éléments légers (C,H,O,N) tels que les polymères et les matériaux biologiques qui ne sont pas directement observables.

   Mode opératoire

        Appareillages

Cette technique peut être réalisée sans appareillage spécifique. Cependant il existe dans le commerce des dispositifs permettant de traiter plusieurs préparations à la fois avec plus de rigueur et de reproductibilité qu’à la main.

      - Constructeurs et partenaires :

            - Cordouan Technologies

        Procédures

Pour les coupes ultraminces d’échantillons polymères on utilise essentiellement des oxydants fortement volatils (oxyde de ruthénium, tétroxyde d’osmium) qui vont agir sur les doubles liaisons. La préparation est déposée sur une grille support en nickel (plutôt qu’en cuivre lui-même facilement oxydé). On utilise ces produits en solution aqueuse placée dans une enceinte confinée (boîte de Pétri ou pilulier fermé). La grille est suspendue ou a distance d’une goutte de liquide sans être en contact avec celui-ci ; seules les vapeurs émises par l’oxydant réagiront avec l’échantillon. Attention ces vapeurs sont très oxydantes donc très toxiques pour le manipulateur. La préparation est laissée en présence de ces vapeurs, selon la nature des échantillons, de 1h à 24h. Après avoir sortiela grille support de l’enceinte confinée et laissé échapper les vapeurs résiduelles sous hotte, elle peut être observée directement.

Pour les coupes ultraminces de matériaux biologiques inclus dans une résine époxy on pratique le plus souvent un double contraste faisant intervenir d’abord un sel d’uranium et ensuite un sel de plomb. L’acétate d’uranyle est mis en solution à une concentration proche de la saturation de 0,5 à 9 % selon le solvant utilisé (eau, éthanol, méthanol). Les solutions les plus concentrées étant les plus contrastantes.
La grille est mise en contact avec la solution pendant 5 minutes à plusieurs heures à température ambiante ou à chaud (jusqu’à 60°C). Dès que le laps de temps choisi est atteint, la grille est immédiatement rincée par un courant de solvant correspondant, puis à l’eau. Plusieurs rinçages sont nécessaires pour éliminer toutes traces du contrastant non chimiquement liées aux structures. La grille est ensuite laissée séchée quelques heures à une nuit avant d’entreprendre le 2ème contraste. La deuxième solution utilisée est un sel de citrate de plomb obtenu par réaction de nitrate de plomb et de citrate de sodium en solution aqueuse à pH voisin de 12. Le contraste est réalisé dans une enceinte close (boîte de Pétri plastique) contenant des pastilles de soude pour assurer une atmosphère sèche et basique, dépourvue de CO2. Les grilles, côté coupes, sont déposées sur des gouttes de la suspension de contrastant pendant un temps court de 1 à 5 minutes. La grille est ensuite rincée par un courant d’eau distillée, puis laissée séchée avant d’être observée.

Pour les particules en suspension le contraste est pratiqué immédiatement après avoir effectué la dilution et le dépôt (voir 4.1) et avant séchage complet de la grille support. Cette dernière est retournée sur une goutte de suspension d’uranyle, pendant 1 à 5 minutes avant d’être rincée comme précédemment. Le contraste au plomb se fera toujours sur une grille sèche.

   Variantes

Il existe beaucoup de variante dans le choix des métaux contrastants, des concentrations des solutions, des solvants de dissolution, et des températures de réactions. Il existe également de nombreuses variantes dans le mode opératoire.

Fig. 7.3-1 : Appareil de golgi et mitochondries sans contraste positif.
Fig. 7.3-2 : Appareil de Golgi et mitochondries après contraste positif uranyle/plomb


   Avantages

C’est une technique rapide de renforcement du contraste pour des échantillons transparents aux électrons. La fixation des métaux lourds se fait sur des sites réactifs spécifiques ce qui conduit à marquer certaines zones et d’autres pas, selon les structures chimiques, et ainsi de pouvoir les différencier. C’est une technique incontournable pour faciliter l’observation des matériaux organiques (non calcifiés) qui se pratique après la fixation, l’inclusion et la réalisation des coupes ultra-minces.

   Inconvénients

Cette technique n’est possible que si l’échantillon présente des sites réactifs par exemple des doubles liaisons dans les polymères. La spécificité de ces sites réactifs est chimiquement mal connue et n’est donc pas toujours prévisible. Elle modifie la composition chimique de l’échantillon et peut gêner l’analyse.

   Artéfacts

Cette technique peut conduire à l’apparition de précipités de sels métalliques sur la coupe si toutes les conditions de préparation ne sont pas bien maîtrisées. Ces précipités sont très instables sous le faisceau d’électrons et leur fusion peut entraîner une couche de contamination.

   Types d'analyses

Structure

   Risques

Il y a des risques toxiques dus à l’inhalation ou l’ingestion des solvants utilisés (méthanol…), et des métaux lourds (plomb en particulier). Il y a des risques d’irritation et d’attaque des voies respiratoires provoquées par les vapeurs des oxydants. Il y a des risques cancérigènes dus aux rayonnements radioactifs de l’uranium. Cette méthode exige de travailler sous hotte.

   Conclusion

C’est une technique de routine pour les matériaux biologiques qui s’emploie aussi pour les polymères. Elle permet dans ce cas de différencier les polymères insaturés de ceux qui le sont et de définir des phases différentes dans un polymère complexe.
Pour les matériaux biologiques les mêmes atomes lourds -osmium, uranium- peuvent être utilisées pour la fixation chimique (2.11), le contraste négatif (7.2) et le contraste positif. La différence proviendra essentiellement du temps de réaction : plusieurs heures pour la fixation, quelques minutes à 1h pour le contraste positif, (suivi d’un rinçage) et quelques dizaines de secondes pour le contraste négatif (sans rinçage).

   Bibliographie

Hayat M.A. (2000) Principles and Techniques of Electron Microscopy : Biological Applications; CRC Press

Lewis P.R. (1977) Staining methods for Sectioned Material vol 6, part 1 in Pratical methods in electron microscopy. Glauert A.M ed., North-Holland Publisher

Pottu-Boumendil J. (1989) Techniques en microscopie électronique. Les éditions INSERM, Paris

Reynolds E.S. (1963) The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. J. Cell Biol., 17, 208

   Informations complémentaires



         
Auteurs : Jeanne Ayache, Luc Beaunier, Jacqueline Boumendil, Gabrielle Ehret, Danièle Laub                     http://temsamprep.in2p3.fr
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